|
|
Critical sites determining the resistance phenotype of ABC proteins from the ARE subfamily and the molecular mechanism of their function
Lenart, Jakub
Rezistenční proteiny Vga(A) a Msr(A) patřící do ARE podrodiny ABC-F proteinů udělují rezistenci k antimikrobiálním látkám, k tzv. inhibitorům peptidyltransferázového centra. V minulosti se předpokládalo, že jejich mechanizmus rezistence je založen na interakci s transmembránovým partnerem za vytvoření funkčního transportéru. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie a mutant neschopných hydrolýzy ATP bylo popsáno jejich působení na ribozomu. I když byla jejich lokalizace popsána, přesný mechanismus působení není do dnešního dne znám. Přípravou mutovaných proteinů kombinujících čtyři aminokyselinové zbytky Vga(A) a Vga(A)LC ve špičce linkeru, jsme jako první popsali vliv substrátové specificity jednotlivých mutant. Aminokyselinová pozice 212 a 220 je důležitá pro rezistenci k linkosamidům a pleuromutilínům, přičemž pozice 219 k streptogramínům A. Povaha jednotlivých aminokyselin hraje zásadní roli v udělování antibiotické specificity, co potvrzuje fakt, že aminokyselinová záměna v pozici K218T na pozadí proteinu Vga(A) způsobila posun rezistence od streptogramínů k linkosamidům a pleuromutilínům. Mechanizmus rezistence u buněk exprimujících vga(A) spočívá v ribozomální ochraně. Tomu také nasvědčuje fakt, že míra akumulace [3H]-linkomycinu u Vga(A) je velmi podobná s kmenem exprimujícím erm(C)....
|
|
|
Subcellular localization of resistant proteins Vga(A)LC and Msr(A) using fluorescence microscopy
Nguyen Thi Ngoc, Bich ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Vga(A)LC a Msr(A) jsou klinicky významnými rezistentními proteiny u stafylokoků, které udělují rezistenci k inhibitorům translace. Patří mezi ARE ABC-F podrodinu proteinů, která je součástí ABC transportérů. Narozdíl od typických ABC transportérů, ABC-F proteiny nemají transmembránové domény, které jsou zodpovědné za transport látek přes membránu. Proto pro ně není charakteristická transportní funkce, ale regulační nebo rezistenční funkce. Jejich mechanismus působení na ribozomu byl popsán teprve nedávno, kde tyto proteiny vytěsňují antibiotikum z ribozomu. Stále jsou však některé aspekty jejich funkce neobjasněné. Například to, jaký je význam umístění Vga(A) na membráně, které bylo detekováno v membránové frakci nikoliv v ribozomální. V této práci jsem prostřednictvím fluorescenční mikroskopie pozorovala subcelulární lokalizaci rezistenčních fúzních proteinů Vga(A)LC-mEos2, Vga(A)LC- GFP a Msr(A)- eqFP650 v živých buňkách S. aureus, za různých kultivačních podmínek. Ukázalo se, že Vga(A)LC- GFP i Msr(A)- eqFP650 se vyskytují v ohnisku blízko membrány. V závislosti na ATPázové aktivitě nebo přítomnosti antibiotika se lokalizace Msr(A)- eqFP650 v buňce mění z ohniskové na difuzní, pravděpodobně na ribozomech, což navrhuje hypotézu o duálním mechanismu ARE ABC-F proteinů. Druhým cílem práce bylo...
|
|
|
The effect of aminoacid variability on the resistance phenotype in ARE subfamily of ABC proteins
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
ARE podrodina proteinů patřící k ABC transportérům uděluje v různé míře rezistenci k makrolidovým, linkozamidovým a streptograminovým antibiotikům. Mezi klinicky nejvýznamnější proteiny ARE podrodiny u stafylokoků patří Vga(A) protein udílející rezistenci ke streptogtraminům A. V roce 2006 byla objevena jeho nová varianta označována jako Vga(A)LC, která kromě streptograminů A uděluje také rezistenci k linkosamidům. Vga(A) a Vga(A)LC se liší pouze v 7 aminokyselinách, přesto udílejí odlišný rezistenční fenotyp. V předchozích experimentech bylo zjištěno, že centrální roli v určení substrátové specificity hrají 4 aminokyselinové rozdíly, které jsou nahloučené v úseku 15 aminokyselin uvnitř linkeru spojující dvě ABC domény (pozice 212, 219, 220 a 226). Kombinace aminokyselin LGAG z Vga(A) zvyšuje rezistenci k streptogramínům A, zatímco kombinace SVTS přítomná ve Vga(A)LC zvyšuje rezistenci k linkosamidům. Přestože do této podrodiny patří velké množství rezistenčních proteinů, mechanismus rezistence nebyl dosud s jistotou prokázán. Cílem práce bylo vytvoření nových Vga(A) variant, které obsahují kombinace aminokyselin specifických pro Vga(A) a Vga(A)LC protein v pozicích 212, 219, 220 a 226 a porovnání jejich schopnosti udeľovať rezistenci k linkosamidům. Také jsme zkoumali vliv mutací v téže variabilní části...
|
|
|
Critical sites determining the resistance phenotype of ABC proteins from the ARE subfamily and the molecular mechanism of their function
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Melter, Oto (oponent) ; Branny, Pavel (oponent)
Rezistenční proteiny Vga(A) a Msr(A) patřící do ARE podrodiny ABC-F proteinů udělují rezistenci k antimikrobiálním látkám, k tzv. inhibitorům peptidyltransferázového centra. V minulosti se předpokládalo, že jejich mechanizmus rezistence je založen na interakci s transmembránovým partnerem za vytvoření funkčního transportéru. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie a mutant neschopných hydrolýzy ATP bylo popsáno jejich působení na ribozomu. I když byla jejich lokalizace popsána, přesný mechanismus působení není do dnešního dne znám. Přípravou mutovaných proteinů kombinujících čtyři aminokyselinové zbytky Vga(A) a Vga(A)LC ve špičce linkeru, jsme jako první popsali vliv substrátové specificity jednotlivých mutant. Aminokyselinová pozice 212 a 220 je důležitá pro rezistenci k linkosamidům a pleuromutilínům, přičemž pozice 219 k streptogramínům A. Povaha jednotlivých aminokyselin hraje zásadní roli v udělování antibiotické specificity, co potvrzuje fakt, že aminokyselinová záměna v pozici K218T na pozadí proteinu Vga(A) způsobila posun rezistence od streptogramínů k linkosamidům a pleuromutilínům. Mechanizmus rezistence u buněk exprimujících vga(A) spočívá v ribozomální ochraně. Tomu také nasvědčuje fakt, že míra akumulace [3H]-linkomycinu u Vga(A) je velmi podobná s kmenem exprimujícím erm(C)....
|
|
|
Subcellular localization of resistant proteins Vga(A)LC and Msr(A) using fluorescence microscopy
Nguyen Thi Ngoc, Bich ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Vga(A)LC a Msr(A) jsou klinicky významnými rezistentními proteiny u stafylokoků, které udělují rezistenci k inhibitorům translace. Patří mezi ARE ABC-F podrodinu proteinů, která je součástí ABC transportérů. Narozdíl od typických ABC transportérů, ABC-F proteiny nemají transmembránové domény, které jsou zodpovědné za transport látek přes membránu. Proto pro ně není charakteristická transportní funkce, ale regulační nebo rezistenční funkce. Jejich mechanismus působení na ribozomu byl popsán teprve nedávno, kde tyto proteiny vytěsňují antibiotikum z ribozomu. Stále jsou však některé aspekty jejich funkce neobjasněné. Například to, jaký je význam umístění Vga(A) na membráně, které bylo detekováno v membránové frakci nikoliv v ribozomální. V této práci jsem prostřednictvím fluorescenční mikroskopie pozorovala subcelulární lokalizaci rezistenčních fúzních proteinů Vga(A)LC-mEos2, Vga(A)LC- GFP a Msr(A)- eqFP650 v živých buňkách S. aureus, za různých kultivačních podmínek. Ukázalo se, že Vga(A)LC- GFP i Msr(A)- eqFP650 se vyskytují v ohnisku blízko membrány. V závislosti na ATPázové aktivitě nebo přítomnosti antibiotika se lokalizace Msr(A)- eqFP650 v buňce mění z ohniskové na difuzní, pravděpodobně na ribozomech, což navrhuje hypotézu o duálním mechanismu ARE ABC-F proteinů. Druhým cílem práce bylo...
|
|
|
Vliv exprese genu lmr(C) na biosyntézu linkomycinu u Streptomyces lincolnesis: Rezistence nebo produkce?
Veselá, Ludmila ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Rod Streptomyces produkuje víc jak polovinu známých bioaktivních látek, čímž se řadí mezi významné bakteriální rody. Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 ve svém genomu obsahuje biosyntetický genový klastr pro biosyntézu linkomycinu. Vedle biosyntetických a regulačních genů klastr obsahuje také tři rezistenční geny, lmr(A), lmr(B) a lmr(C), u kterých se předpokládá zapojení v ochraně před toxicitou syntetizovaného antibiotika. Protein Lmr(C) patří mezi ARE proteiny obecně udílející rezistenci ke klinicky důležitým třídám antibiotik: makrolidům, streptograminům, linkosamidům a pleuromutilinům. ARE proteiny jsou vedle producentů těchto antibiotik přítomny také u patogenních mikroorganismů. Přesto mechanismus rezistence udílený těmito proteiny, které sice spadají mezi ABC transportéry, ale na rozdíl od nich postrádají transmembránovou doménu, není charakterizován. Tím se ARE proteiny stávají zajímavým předmětem výzkumu. Prostřednictvím delečních mutant v rezistenčních genech lmr(A), lmr(B) a lmr(C) jsme zjišťovali vliv těchto genů na produkci linkomycinu a rezistenci k linkosamidům, linkomycinu a klindamycinu, a to se zvláštním zřetelem na funkci lmr(C). Zjistili jsme, že delece genu lmr(C) zásadně neovlivňuje produkci a ani rezistenci k linkomycinu, avšak má výrazný vliv na rezistenci ke...
|
|
|
The effect of aminoacid variability on the resistance phenotype in ARE subfamily of ABC proteins
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
ARE podrodina proteinů patřící k ABC transportérům uděluje v různé míře rezistenci k makrolidovým, linkozamidovým a streptograminovým antibiotikům. Mezi klinicky nejvýznamnější proteiny ARE podrodiny u stafylokoků patří Vga(A) protein udílející rezistenci ke streptogtraminům A. V roce 2006 byla objevena jeho nová varianta označována jako Vga(A)LC, která kromě streptograminů A uděluje také rezistenci k linkosamidům. Vga(A) a Vga(A)LC se liší pouze v 7 aminokyselinách, přesto udílejí odlišný rezistenční fenotyp. V předchozích experimentech bylo zjištěno, že centrální roli v určení substrátové specificity hrají 4 aminokyselinové rozdíly, které jsou nahloučené v úseku 15 aminokyselin uvnitř linkeru spojující dvě ABC domény (pozice 212, 219, 220 a 226). Kombinace aminokyselin LGAG z Vga(A) zvyšuje rezistenci k streptogramínům A, zatímco kombinace SVTS přítomná ve Vga(A)LC zvyšuje rezistenci k linkosamidům. Přestože do této podrodiny patří velké množství rezistenčních proteinů, mechanismus rezistence nebyl dosud s jistotou prokázán. Cílem práce bylo vytvoření nových Vga(A) variant, které obsahují kombinace aminokyselin specifických pro Vga(A) a Vga(A)LC protein v pozicích 212, 219, 220 a 226 a porovnání jejich schopnosti udeľovať rezistenci k linkosamidům. Také jsme zkoumali vliv mutací v téže variabilní části...
|
host ::
RSS.